基因工程（六）

(51).PCR大概要经历30次循环，每次循环可分为三步：

<1>.变性：温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。

<2>.复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。（引物中G与C含量越高或长度越长，复性温度越高）

<3>.延伸：温度上升到72℃（Taq酶最适温度）左右时，溶液中4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

(52).PCR过程可在PCR扩增仪中自动完成，完成后常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定其产物。

(53).琼脂糖凝胶电泳的原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下这些基团可带上正电荷或负电荷。在电场作用下，这些带电分子会向其所带电荷相反的电极移动。

(54).凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。

(55).凝胶中的DNA分子通过染色可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。

(56).DNA片段的扩增以及电泳鉴定：

<1>.将所用PCR扩增所需组分用微量移液器加入微量离心管离心约10s后（使反应液集中在离心管底部）放入PCR仪中。

<2>.根据待分离DNA片段的大小用电泳缓冲液配置琼脂糖溶液（质量分数一般为0.8%～1.2%），在沸水浴中（或微波炉内）加热至琼脂糖熔化，稍冷却后加入适量的核酸染料混匀。

<3>.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子以形成加样孔。待凝胶完全凝固后拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。

<4>.将电泳缓冲液加入电泳槽中，以没过凝胶1mm为宜。

<5>.将PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔中。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。

<6>.接通电源，根据电泳槽阴阳两极之间的距离设定电压（一般为1～5V/cm）。

<7>.待指示剂前沿迁移至凝胶边缘时停止电泳，取出凝胶置于紫外灯下观察照相。

(57).为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的所有器材和蒸馏水等都需高压灭菌处理。缓冲液和酶在-20℃储存，使用前从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

(58).用微量移液器向微量离心管中添加组分时，每吸取一种试剂后，移液器的枪头都必须更换。

(59).转化：目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。