二、微生物培养与无菌技术核心知识梳理
一、无菌技术：防止杂菌污染的关键
核心目标：获得纯净微生物培养物，分为消毒和灭菌。
1. 消毒（温和处理，部分杀菌）
- 定义：用物理、化学或生物方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。
- 常用方法及应用：
方法 原理/特点 应用场景
煮沸消毒法 100℃煮沸10-30分钟 玻璃器皿、餐具
巴氏消毒法 62-65℃加热30分钟或70-75℃加热15秒 牛奶、酒类（保留营养成分）
紫外线消毒 紫外线破坏DNA结构 实验室空气、操作台、衣物
化学消毒 75%酒精（擦拭双手）、氯气（消毒水源） 皮肤、水源、实验设备
生物消毒 噬菌体裂解细菌 净化污水
2. 灭菌（强烈处理，彻底杀菌）
- 定义：用理化方法杀死物体内外所有微生物（包括芽孢和孢子）。
- 常用方法及应用：
方法 条件 应用场景
高压蒸汽灭菌 121℃、100kPa、15-30分钟 培养基、玻璃器皿、棉塞
灼烧灭菌 酒精灯火焰直接灼烧 接种环、涂布器、试管口
干热灭菌 160-170℃、2小时 耐高温干燥的玻璃/金属器具
3. 操作原则
- 环境与人员：实验空间清洁，操作者手和衣物消毒（如酒精擦拭）。
- 器具与培养基：所有接触培养物的器皿（培养皿、试管）和培养基必须灭菌。
- 无菌操作：在超净工作台或酒精灯火焰旁操作（火焰周围形成无菌区域），避免灭菌后的器具接触周围物品。
难点解释：
- 消毒 vs 灭菌：消毒不彻底（保留芽孢），灭菌彻底；例如，培养基必须灭菌（含芽孢会导致污染），而皮肤只需消毒（避免强刺激）。
- 为什么选择巴氏消毒法？ 因高温会破坏牛奶中的营养成分和口感，巴氏消毒在杀菌的同时最大限度保留营养（如维生素）。
二、微生物的纯培养
核心概念：从单一微生物繁殖获得纯培养物，是微生物研究的基础。
1. 纯培养步骤
1. 配制培养基：
- 成分：碳源、氮源、水、无机盐，按需添加特殊成分（如凝固剂琼脂）。
- 流程：计算→称量→溶解→定容→调pH→灭菌→倒平板。
- 关键细节：
- 斜面培养基需先分装再灭菌，避免灭菌后分装导致污染。
- 倒平板时，培养基冷却至50℃左右（手背触碰锥形瓶不烫手），避免高温破坏皿盖冷凝水。
2. 倒平板操作：
- 步骤：灼烧瓶口→打开培养皿缝隙→倒入培养基→倒置冷却。
- 为什么倒置平板？ 防止皿盖冷凝水倒流污染培养基，同时避免培养基水分过快蒸发。
- 污染判断：若培养基溅到皿盖与皿底之间，该平板不可用（空气中微生物易在缝隙滋生）。
3. 接种与分离方法：
方法 原理 用途 关键区别
平板划线法 通过连续划线稀释菌液，获得单菌落 分离纯菌种 无法计数，需多次划线
稀释涂布平板法 将菌液梯度稀释后涂布，统计菌落数 分离菌种并计数 需选择30-300菌落的平板
操作要点：
- 划线时每次灼烧接种环并冷却，避免高温杀死菌种；从上次划线末端开始，逐步稀释菌液。
- 涂布时菌液需完全吸收，避免菌落重叠影响计数。
4. 培养与观察：
- 接种后平板倒置，放入恒温箱（如酵母菌28℃培养24-48小时）。
- 设置未接种平板的意义：作为对照，若对照平板出现菌落，说明培养基或操作过程污染，实验结果无效。
难点解释：
- 单菌落的意义：一个单菌落通常由单个微生物繁殖形成，是纯培养物的标志。
- 为什么菌落数比活菌数少？ 当多个活菌连在一起时，平板上仅形成一个菌落（稀释涂布平板法的计数误差）。
三、菌种保存方法
方法 条件 适用范围 操作要点
临时保存 固体斜面培养基，4℃冰箱 短期使用（3-6个月） 定期转接，避免菌种退化
甘油管藏（长期） 菌液与甘油混合，-20℃冷冻 长期保存（数年） 灭菌甘油需与菌液等体积混合
难点解释：
- 临时保存需定期转接的原因：斜面培养基营养有限，长期保存会导致菌种衰老或死亡。
- 甘油管藏的原理：甘油作为保护剂，降低细胞内水分结晶对菌体的损伤，适合长期冷冻。
四、微生物的选择培养与计数
1. 选择培养基的设计原理
通过特定成分限制非目标微生物生长，富集目标菌种：
- 例子1：分离尿素分解菌
- 培养基：以尿素为唯一氮源，只有能分泌脲酶的细菌（如大肠杆菌）可生长。
- 鉴别：加入酚红指示剂，分解尿素产生NH₃使培养基pH升高，指示剂变红。
- 例子2：分离纤维素分解菌
- 培养基：以纤维素为唯一碳源，仅能产生纤维素酶的细菌（如木霉）可利用。
- 鉴别：加入刚果红，与纤维素形成红色复合物；纤维素被分解后，菌落周围出现透明圈（透明圈直径/菌落直径越大，分解能力越强）。
2. 计数方法对比
方法 原理 优点 缺点
稀释涂布平板法 活菌形成单菌落，统计菌落数推算活菌数 可区分活菌，误差较小 操作繁琐，不适用于运动细菌
显微镜直接计数法 血细胞计数板直接计数（死菌活菌均算） 快速简便 无法区分死活，小细菌难观察
难点解释：
- 选择培养基的“唯一”原则：如“无氮培养基”仅固氮菌可生长，“无碳培养基”仅自养菌（如蓝细菌）可利用CO₂作为碳源。
- 刚果红染色法的两种操作：先培养后染色（避免刚果红抑制微生物）或在培养基中直接加入刚果红，均需形成透明圈判断分解能力。
五、核心操作流程图解
无菌技术流程：
实验准备（清洁环境→消毒双手）→器具灭菌（培养基、培养皿高压蒸汽灭菌）→
倒平板（冷却至50℃→无菌操作倒平板→倒置凝固）→
接种（平板划线法/稀释涂布平板法，酒精灯旁操作）→
培养（倒置恒温箱，设未接种对照）→
结果分析（对照无污染→单菌落分离成功）
总结与难点强化
1. 核心逻辑：无菌技术是基础，纯培养是目标，选择培养和计数是应用。
2. 易错点突破：
- 混淆消毒与灭菌的对象（芽孢是否被杀灭）；
- 忽略倒平板倒置的双重作用（防污染+保水分）；
- 稀释涂布平板法计数时忘记“菌落可能由多个活菌形成”导致低估。
3. 学科思想：
- 选择性原理：通过培养基成分设计，实现微生物的“优汰劣胜”（如青霉素抑制细菌，分离真菌）；
- 量化思维：稀释涂布平板法的数学逻辑（菌落数×稀释倍数÷涂布体积=活菌浓度）。
通过明确操作目的（如灭菌为何需高温）、理解原理（如选择培养基的筛选机制）、牢记特例（如巴氏消毒的低温原因），可高效掌握微生物培养的核心考点。
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