基因工程（二）

(6).基因工程的技术支持：

<1>.基因转移载体和工具酶的发现。

<2>.DNA体外重组的实现。

<3>.重组DNA表达实验的成功。

<4>.PCR技术的发明。

(7).基因工程的核心步骤：基因表达载体的构建。

(8).要实现重组DNA技术需要三个基本工具：

<1>.限制性内切核酸酶【分子手术刀】：简称限制酶，具有特异性，主要从原核生物中分离纯化出来。可以识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，可重复利用。

<2>.DNA连接酶【分子缝合针】：一种通过恢复被限制酶切开的磷酸二酯键而将两个DNA片段连接起来的酶，不需要模板，形成双链，可重复利用。

<3>.基因进入受体细胞的载体【分子运输车】：通常为质粒，还有噬菌体、动植物病毒等。不能直接运用于基因工程，提取后需进行人工改造。

(9).大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成（如EcoRI、SmaI限制酶），但也有由4或8个核苷酸组成识别序列的限制酶。

(10).限制酶不剪切细菌本身DNA分子的原因：

<1>.细菌DNA分子不具备该种限制酶的识别序列。

<2>.细菌通过甲基化酶将甲基转移到限制酶识别序列的碱基上，使限制酶无法对原有识别序列进行识别。

(11).DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端分为黏性末端（在识别序列的中轴线两侧切开）和平末端（在识别序列的中轴线切开）两种。

(12).常用DNA连接酶主要有：

<1>.E.coli DNA连接酶：从大肠杆菌中分离，只能连接具有互补粘性末端的DNA片段。

<2>.T4DNA连接酶：从T4噬菌体中分离，既可以连接性黏性末端也可以连接平末端，但连接平末端的效率相对较低。

(13).质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子，其上基因属于细胞质基因。

(14).能作为载体运输基因的质粒（其他“运输车”同）需满足：

<1>.有一个至多个限制酶切割位点供外源DNA片段插入。

<2>.能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制。

<3>.具有特殊的标记基因（如四环素抗性基因、氨苄青霉素、产物具有颜色反应的基因等），便于重组DNA分子的筛选。

<4>.对受体细胞无害、易分解。