核酸

小王核苷酸可以作为核酸分子组成单位。核苷酸可以作为高能分子。核苷酸能作为许多酶的辅因子，如腺苷是烟酰胺核苷酸、黄素腺嘌呤核苷酸、辅酶a的成分。核苷酸可以作为信号分子，最常见的第二信使是环腺苷酸。核苷酸能作为糖基载体，如葡萄糖与udp，adp，gdp结合。核苷是通过核苷键，将戊糖和碱基连接而成，核苷构象有同向反向之分，同向核苷表示嘌呤的6元环朝向糖环一侧，反向则表示远离糖环一侧，核苷多呈反向构象。假尿苷的尿嘧啶以碳碳键与核糖相连，其余嘌呤嘧啶均以氮碳键相连。核糖核苷酸1号位连碱基，2号位，3号位连羟基，4号位上连5号碳，5号碳上连磷酸。而脱氧核糖核苷酸2号位上羟基脱去氧只剩氢。

小王DNA的1级结构：DNA是四种脱氧核糖核苷酸以3，5-磷酸二酯键连接起来的多核苷酸链，DNA一级结构是指，脱氧核糖核苷酸在多核苷酸链上的排列顺序。基因组是一种生物或细胞的遗传物质综合。细菌DNA为双链环状，基因通常连续存在，相关基因受共同调节。除了拟核中DNA外，在染色体外还有游离的小的环状DNA分子，称为质粒，是一种独立于染色体之外，能自我复制的细胞遗传因子，不属于基因组原核，真核原核中均有质粒。DNA双螺旋结构特点，两条链反向平行，为右手螺旋，两条由磷酸和脱氧核糖形成的主链骨架位于外侧，碱基位于双螺旋内侧。碱基面与中心轴垂直，糖环平面与轴平行，碱基与碱基互补配对，以氢键相连。双螺旋平均直径2nm。螺距为3.4nm，每圈螺旋有10对碱基。相邻两各碱基夹角36度。遗传信息储存在碱基序列中，碱基在一条链上排列顺序不受限。双螺旋表面有两条凹槽，一个宽深称为大沟，另一个窄浅称为小沟，碱基侧面的功能基团朝向大沟，利于DNA遗传信息传递和表达时，功能蛋白质与DNA特异识别。横向以氢键连接，纵向碱基平面之间通过疏水作用和范德华力，产生碱基堆积力，是稳定dna双螺旋最重要因素。DNA多为B型，当相对湿度较低时，形成A型。A型比B型粗短一些，大沟变深，小沟变浅。而z型则比B型细长而伸展，变为左手螺旋。

小王超螺旋是由DNA双螺旋轴进一步卷曲所形成的一种DNA高级结构，或称为3级结构。超螺旋程度越高分子密度越大。以超螺旋形式存在，有助于DNA分子在细胞内的包装，也是DNA实现复制，转录，重组等功能所需要的。RNA的结构特点，大多RNA为单链分子，连键性质和DNA一样。RNA的2级结构，包括单链双螺旋区，凸起，内环和发夹结构等，局部双螺旋一般为A-DNA结构。稳定2级结构主要是氢键和碱基堆积力。

小王MRNA种类多而大小不均一，半衰期短。实际含量低。原核生物一般为多顺反子，即一条可以翻译多条不同多肽链，真核生物通常为单顺反子，只编码一条多肽链。真核在5端有一个帽子结构，在三端有多聚腺苷酸尾巴。真核的帽子结构有三种类型，零型的五端核苷酸的核糖未甲基化，一型的末端一个核苷酸的核糖甲基化，二型的末端两个核苷酸的核糖均甲基化。帽子结构能抗五撇核酸外切酶的降解作用，在蛋白质合成中有助于核糖体对它的识别和结合，使翻译正确起始。

小王rRNA在真核和原核生物中差异大，但都存在甲基化现象。原核中有5，16，23，真核中有5，5.8，18，28。大肠杆菌16s上有10个甲基化核苷酸，23s上有20个甲基化核苷酸，大多在腺苷酸或鸟苷酸上。真核动物的18s和28s上分别有43和74个甲基化位点。原核23s能作为核酶催化肽键形成。

小王TRNA的碱基组成中有较多稀有碱基，它的三末端通常为CCA序列，五末端多为pG，也有pC。2级结构呈三叶草型。由氨基酸臂，二氢尿嘧啶环，反密码环，额外环，tc环组成。氨基酸臂末端为cca羟基结构。其羟基与氨基酸形成共价键携带氨基酸。二氢尿嘧啶环通过双螺旋区与tRNA其余部分连接。反密码环上有三个碱基构成反密码子，与mRNA上的密码子识别配对，通过反密码臂与tRNA的其余部分相连。额外环也称可变环，不同TRNA的额外环差别大。 3级结构是tRNA的形状像一个倒L。氨基酸臂与tc臂形成一个连续的双螺旋区，构成字母l下面一横。二氢尿嘧啶臂与反密码臂，反密码环构成一竖。二氢尿嘧啶环中与tc环及额外环的某些碱基形成额外碱基对是维持3级结构的重要因素。

小王RNA的磷酸酯键易被稀碱水解，生成三撇核苷酸和二撇核苷酸混合物，敏感性源于核糖2号位上羟基。DNA的脱氧核糖在2号位没有羟基，所以对碱稳定。而酸水解则是，核酸中糖苷键和磷酸二酯键均能被酸水解，嘌呤的糖苷键更易水解，DNA在3.0 PH下可选择性脱去嘌呤，产生脱嘌呤核酸。限制性内切酶专用于降解异源DNA，有特异性，识别序列一般为4~8碱基对，有回文结构，切割位点在识别位点上，性质稳定，一般需要镁离子和盐离子催化。同时切割DNA两条链，产生平末端，粘性末端。可用于DNA定点切割遗传突变分析，个体指纹分析等。

小王核酸的变性是指天然核酸在某些物理化学因素作用下，双螺旋区因氢键断裂变成单链，现象是紫外吸收升高，粘度下降，生物活性丧失。变性时没有共价键断裂，而是碱基间的氢键和碱基堆积力受到破坏。增色效应是指，核酸变性后紫外吸收增加的现象。Tm是指，DNA热变性时，双螺旋破坏一半所需要的温度，即DNA熔解温度。影响tm的因素，有DNA碱基组成，胞苷酸和鸟苷酸含量越高，tm越高。DNA均一性指cg和at在DNA分子中均匀分布的程度，均一性越高，突发热变性的范围越窄，介质中离子种类和离子强度，离子强度高，核酸tm也高。核酸复性是指，适当条件下变性DNA两条核苷酸链靠氢键配对，重新形成双螺旋，同时活性得到恢复。复性速度与外界因素及核酸长度和核苷酸复杂程度有关。迅速冷却时两条链不能重新闭合，缓慢冷却时才能形成双螺旋。复性的过程分为，两条链相互辨认，先形成一个短的双螺旋片段，该过程较为缓慢。之后两条链通过连续配对，像拉链一样快速形成双链。减色效应是指单链核酸复性形成双螺旋后，因碱基堆积使其紫外吸收降低的变化。

小王核酸的分子杂交是指，两条来源不同但有核苷酸互补关系的DNA单链分子之间，或DNA单链分子与RNA分子之间，在去掉变性条件后，互补的区段能够复性，形成双链DNA分子或DNA -RNA异质双链分子。基本过程是，首先利用限制性内切酶将DNA分子进行酶切，对DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳分离，然后对凝胶上的双链DNA条带进行变性，并原位转移到滤膜上。接着用探针与滤膜上的DNA条带进行杂交反应，最后进行放射自显影。

小王核酸最大吸收峰在260nm附近，而蛋白质最大吸收峰在280nm附近。如果DNA为单链，则吸收值明显增加。所以根据在260nm和280nm下吸光值的比值可以判断样品纯度。比较纯的DNA的260:280值，一般为1.8~2.2。掺入蛋白质或酚类，则会使比值明显下降。掺入RNA则会使比值明显上升。

小王在电镜下染色质为串珠状结构，珠状物称为核小体，是真核生物染色质的重复结构单位，由DNA盘旋组蛋白核心而成。组蛋白核心为八聚体，含有各两个拷贝的H2A，H2B，H3和H4。盘绕组蛋白核心的DNA大多以左手超螺旋形式在组蛋白核心外部盘绕，其余部分用作两个核小体之间的连接。组蛋白H1结合在组蛋白核心外侧DNA双链的进出口端，将DNA链固定在组蛋白八聚体上。

小王DNA分离采用苯酚-氯仿抽提法，分离原则是保持DNA完整性。先破碎细胞，再用合适的缓冲液提取DNA，最后苯酚-氯仿抽提。苯酚是蛋白质变性剂，氯仿是不溶于水的有机溶剂，提取液经过苯酚-氯仿抽提后分为两相，DNA在上层水相中，变性的蛋白质在两相间。用含盐的乙醇二倍体积溶液使DNA沉淀，再用乙醇或乙醚洗涤。为了避免DNA水解为小片段，通常在提取液中加EDTA，它能螯合掉镁离子，而镁离子是DNase的辅因子。同时加入蛋白质变性剂SDS和蛋白酶K，使蛋白质变性DNAse降解失活。同时由于线性DNA分子具有高度不对称性，粘性大，容易引起机械损伤，在分离时应避免给予过多剪切力

小王RNA分离难度较大，因为RNA本身不稳定，而RNA酶性质稳定且无处不在，不需要辅因子即可催化RNA水解。分离关键在于尽量抑制环境中RNA酶活性。通常会对所有玻璃器皿高温烘烤，塑料用具高压灭菌，不能灭菌的要用DEPC处理。DEPC是一类活泼的烷基化试剂，使蛋白质乙基化，破坏RNA酶活性。在提取液中加入蛋白质强变性剂，如异硫氰酸胍。在提取液中加入RNA酶抑制剂。小量制备RNA时常用异硫氰酸钠-苯酚-氯仿溶液抽提，这溶液不仅有助于破坏细胞膜，同时可以变性、沉淀蛋白质，包括核酸酶。

小王核酸密度梯度超离心，常用梯度介质为氯化铯，通过超离心可使蛋白质漂浮在离心管最上层，RNA沉淀在底部，DNA位于中间。介质中加入EB荧光染料。核酸电泳常用琼脂糖凝胶，采用水平板方式。可以分离核酸，如果有已知含量的标准物，可根据条带荧光强度对微量核酸定量分析。电场强度越大分子迁移越快，凝胶浓度越大分子迁移速度越小，相同电泳条件下，核酸分子小，迁移速度大，超螺旋速度大于线状，大于环状DNA。

小王DNA序列测定。化学法又称链断裂法。首先用放射性同位素标记一条链的五撇末端，然后用针对四种碱基的特异性试剂，分别对DNA进行不完全降解，产生4套大小不等的放射性片段。对4套片段进行电泳分离和放射性自显影，最后根据电泳图谱从下而上读出核苷酸序列。双脱氧链终止法原理是，双脱氧核苷酸缺乏三撇羟基末端，在多核苷酸链合成过程中一旦掺入，将使链的延长终止。由于脱氧核苷酸和双脱氧核苷酸的掺入几率不同，就形成不同长度的放射性DNA片段。对四组样品进行电泳分离和放射自显影，从图谱自下而上读出序列，即为被测dna分子的互补顺序。